液相色譜是一類分離與分析技術(shù)，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過程中.為了區(qū)分各種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如，紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
 

　　對液相色譜儀的要求
 

　　1.流動(dòng)相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45μm或更細(xì)的膜過濾)。
 

　　2.流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。
 

　　3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。
 

　　4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。
 

　　5.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如，甲醇等)，因?yàn)椋兯组L霉。
 

　　6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。
 

　　7.C18柱絕對不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。
 

　　8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：
 

　?、僖援惐甲魅軇_洗；
 

　?、诜旁诋惐贾虚g用超聲波清洗；
 

　?、塾?0%稀硝酸清洗；
 

　　9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。
 

　　10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。
 

　　11.要注意柱子的pH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。
 

　　12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的
 

　　流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過渡一下。
 

　　常見故障斷定及解決方法
 

　　(一)保留時(shí)間變化
 

　　1.柱溫變化：柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱
 

　　2.等度與梯度間未能充分平衡：至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱
 

　　3.緩沖液容量不夠：用》25mmol/L的緩沖液
 

　　4.柱污染：每天沖洗柱
 

　　5.柱內(nèi)條件變化：穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相
 

　　6.柱快達(dá)到壽命：采用保護(hù)柱
 

　　(二)保留時(shí)間縮短
 

　　1.流速增加：檢查泵,重新設(shè)定流速
 

　　2.樣品超載：降低樣品量
 

　　3.鍵合相流失：流動(dòng)相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向
 

　　4.流動(dòng)相組成變化：防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀
 

　　5.溫度增加：柱恒溫
 

　　(三)保留時(shí)間延長
 

　　1.流速下降：管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡
 

　　2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化：用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱
 

　　3.鍵合相流失：同前(二)3
 

　　4.流動(dòng)相組成變化：同前(二)4
 

　　5.溫度降低：同前(二)5
 

　　(四)出現(xiàn)肩峰或分岔
 

　　1.樣品體積過大：用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
 

　　2.樣品溶劑過強(qiáng)：采用較弱的樣品溶劑
 

　　3.柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件
 

　　4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品
 

　　5.進(jìn)樣器損壞：更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子
 

　　(五)鬼峰
 

　　1.進(jìn)樣閥殘余峰：每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗
 

　　2.樣品中未知物：處理樣品
 

　　3.柱未平衡：重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑(尤其是離子對色譜)
 

　　4.TFA(肽譜)：每天新配,用抗氧化劑
 

　　5.水污染(反相)：通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水
 

　　(六)基線噪聲
 

　　1.氣泡(尖銳峰)流動(dòng)相脫氣：加柱后背壓
 

　　2.污染(隨機(jī)噪聲)：清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑
 

　　3.檢測器燈連續(xù)噪聲：更換氘燈
 

　　4.電干擾(偶然噪聲)：采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)
 

　　5.檢測器中有氣泡：流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓
 

　　(七)峰拖尾
 

　　1.柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
 

　　2.峰干擾：清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相
 

　　3.硅羥基作用：
 

　　加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品
 

　　4.同前(四)4同前(四)4
 

　　5.同前(四)35.同前(四)3
 

　　6.死體積或柱外體積過大：
 

　　連接點(diǎn)降至低,對所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管
 

　　7.柱效下降：
 

　　用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱
 

　　(八)峰展寬
 

　　1.進(jìn)樣體積過大：同(四)1
 

　　2.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展L進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散
 

　　3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)
 

　　4.檢測器時(shí)間常數(shù)過大:設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%
 

　　5.流動(dòng)相粘度過高:增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相
 

　　6.檢測池體積過大:用小體積池,卸下熱交換器
 

　　7.保留時(shí)間過長:等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫
 

　　8.柱外體積過大:將連接管徑和連接管長度降至最小
 

　　9.樣品過載:進(jìn)小濃度小體積樣品